ALL libraries (COBIB.SI union bibliographic/catalogue database)
  • Optimizacija predpriprave vzorca bakterijskega lizata E. coli za analizo vsebnosti izooblik plazmidne DNA s kapilarno gelsko elektroforezo [Elektronski vir] = Optimization of E. coli bacterial lysate preparation for the analysis of plasmid DNA isoform composition by capillary gel electrophoresis : magistrska naloga : enoviti magistrski študijski program Farmacija
    Hreščak, Sara
    Plazmidna DNA (pDNA) ima pomembno vlogo v sodobni biotehnologiji, zlasti pri razvoju genske terapije ter cepiv z DNA in mRNA. Pridobivanje pDNA vključuje vse od načrtovanja plazmidnih vektorjev, ... gojenja bakterijske kulture, žetve biomase in lize celic, čiščenja pDNA, do vmesne in končne analitike. Po alkalni lizi bakterijskih celic se nečistote, kot so RNA, proteini, kromosomska DNA, iz vzorca najprej odstranijo z uporabo različnih kromatografskih in nekromatografskih tehnik s ciljem pridobiti produkt z visoko vsebnostjo dodatno zvite oblike (SC) pDNA. V končnem produktu se za natančno določitev posameznih konformacijskih oblik pDNA uporablja kapilarna gelska elektroforeza (CGE), kjer je za učinkovito elektrokinetsko injiciranje ključnega pomena nizka prevodnost analiziranega vzorca, za kar je potreben postopek razsoljevanja. Namen naloge je bila analiza kompleksnega biološkega vzorca – lizata E. coli – s CGE in v ta namen raziskati ter optimizirati metode njegove ustrezne predpriprave. Z eksperimentalnim delom smo potrdili, da je predpriprava vzorca pDNA bistvena za uspešno analizo. Za odstranjevanje soli iz lizata smo testirali različne centrifugalne filtre. Najboljše rezultate sta dosegla filtra z membrano iz regenerirane celuloze in izključitveno molekulsko maso (MWCO) 10 kDa, saj sta omogočila učinkovito odstranjevanje soli ob minimalnih izgubah RNA in pDNA. Ugotovili smo, da trije cikli centrifugiranja predstavljajo optimalno ravnovesje med časovno učinkovitostjo in doseženo občutljivostjo analize s CGE. Kot alternativo smo preizkusili tudi prototipno monolitno centrifugalno kolono, ki deluje na principu anionske izmenjevalne kromatografije. Nukleinske kisline iz lizata smo na kolono vezali v specifičnih pogojih in jih nato uspešno eluirali z raztopino 0,1-kratnega pufra tris-borat-EDTA, kar predstavlja pogoje, primerne za nadaljnjo analizo s CGE. Ta pristop je omogočil še učinkovitejše odstranjevanje soli kot s centrifugalnimi filtri, s krajšim časom obdelave in razmeroma nizkimi izgubami nukleinskih kislin, kar smo potrdili tudi z analizo s tekočinsko kromatografijo.
    Type of material - master's thesis ; adult, serious
    Publication and manufacture - Ljubljana : [S. Hreščak], 2025
    Language - slovenian
    COBISS.SI-ID - 251572483

    Link(s):

    https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?id=173518

Shelf entry