VSE knjižnice (vzajemna bibliografsko-kataložna baza podatkov COBIB.SI)
  • Razvoj večatributivnega orodja na osnovi sekvenciranja nove generacije za visokoprepustno genetsko vrednotenje celičnih linij [Elektronski vir] = Development of a next-generation sequencing-based multi-attribute tool for high throughput genetic characterization of cell lines : magistrsko delo : magistrski študijski program Laboratorijska biomedicina
    Šifkovič, Lara
    V zadnjih desetletjih se je proizvodnja boloških zdravil močno razširila, pri čemer imajo ključno vlogo stabilne in visoko produktivne celične linije. Te linije predstavljajo osnovo za proizvodnjo ... kompleksnih biomolekul, kot so monoklonska protitelesa, encimi in rekombinantni proteini. Genetska integriteta in stabilnost celičnih linij, ki se uporabljajo za proizvodnjo bioloških zdravil, sta ključnega pomena za njihovo dosledno in zanesljivo proizvodnjo - tako v fazi razvoja kot tudi med samo proizvodnjo. Potencialna genetska nestabilnost lahko vpliva na kvaliteto, varnost in učinkovitost končnega produkta, zato je njeno spremljanje bistvenega pomena. Zaradi naraščajoče potrebe po hitrem in učinkovitem razvoju gensko stabilnih celičnih linij se pojavlja potreba po hitrem in zanesljivem genetskem vrednotenju teh linij. V tej magistrski nalogi z naslovom »Razvoj večatributivnega orodja na osnovi sekvenciranja nove generacije za visokoprepustno genetsko vrednotenje celičnih linij« predstavljamo inovativen visokoprepusten pristop, ki temelji na uporabi sekvenciranja naslednje generacije s predhodno ciljno obogatitvijo tarčnih zaporedij. Cilj metode je nadomestiti več tradicionalnih tehnik, ki se trenutno uporabljajo za preverjanje stabilnosti klonov v zgodnji fazi razvoja celičnih linij. Pristop omogoča ocenjevanje intaktnosti in stabilnosti integriranega transgena v gostiteljski celični liniji, detekcijo morebitnih sekvenčnih variant in določitev števila in natačne lokacije integracijskih mest v eni visokoprepustni analitični metodi. S tem omogočamo celovito in natančno vrednotenje genetske stabilnosti celičnih linij v procesu njihovega razvoja, kar prispeva k zagotavljanju njihove kakovosti in učinkovitosti ter posledično k varni in stabilni proizvodnji bioloških zdravil. V prvi fazi naloge smo razvili in optimizirali večatributivno orodje na osnovi sekvenciranja naslednje generacije, poimenovano »digitalni Southern blot«, za visokoprepustno genetsko karakterizacijo celičnih linij. Pristop je bil izveden z uporabo protokola Illumina DNA Prep with Enrichment in sekvenciranja naslednje generacije. Postopek je obsegal dvanajst korakov, vključno z izolacijo genomskih deoksiribonukleinskih kislin, pripravo knjižnic za sekvenciranje nove generacije (fragmentacija in označevane fragmentov (»tagmentacija«), čiščenje, pomnoževanje knjižnic in ponovno čiščenje), opcijski korak združevanja knjižnic v skupine (poole) ter obogatitev tarčnih zaporedij. Obogatitv je vključevala hibridizacijo z biotinskimi sondami, zajem tarčnih fragmentov z uporabo streptavidinskih magnetnih kroglic, pomnoževanje obogatenih fragmentov in končno čiščenje. Obogatene knjižnice smo sekvencirali na sistemu Illumina MiSeq, kar je omogočilo pridobitev visoko kakovostnih sekvenčnih podatkov. Za analizo surovih podatkov smo uporabili namenski bioinformatski protokol, zasnovan s programsko opremo CLC Genomics Workbench. Za uspešen razvoj metode in njeno optimizacijo smo natančno preučili možnosti združevanje knjižnic, označenih z unikatnimi sintetičnimi indeksi, v skupine pred korakom obogatitve, kar je bistveno povečalo prepustnost metode. Preučevali smo tudi razmerje med megnetnimi kroglicami in vzorcem v koraku čiščenja pred obogatitvijo, da bi ocelili vpliv na dolžino fragmentov. Ugotovili smo, da razmerje res vpliva na dolžino fragmentov, vendar ne v zadostni meri za bistveno širše pokritje tarčne sekvence. Poleg tega smo analizirali količino vstopne DNA ter zasnovo sond za obogatitev, pri čemer se je izkazalo, da morajo sonde pokrivati celoten integriran vektor, če želimo pridobiti celovite informacije o mestu integracije in sekvenčnih značilnosti transgenov. S tem smo uspešno odgovorili na štiri ključna vprašanja, ki so bila postavljena v okviru optimizacije metode. V drugi fazi smo se osredotočili na primerjavo tradicionalnih metod, ki se uporabljajo za testiranje celičnih linij v zgodnjem razvoju, z našim novim pristopom. V industriji se za pridobitev enakih informacij običajno uporabljajo tri ločene metode. Metoda prenosa po Southernu se uporablja za ocenjevanje integritete in stabilnosti integriranega transgena v gostiteljsko celično linijo. Sekvenciranje po Sangerju se uporablja za zaznavanje sekvenčnih variant, za določanje integracijskih mest pa metoda ciljnjega ojačevanja lokusov. Za primerjavo so bile na izbranem setu vzorcev izvedene tradicionalna metoda prenosa po Southernu, metoda ciljnjega ojačevanja lokusov in »digitalni Southern blot«. S primerjalnimi eksperimenti smo želeli primerjati predvsem specifičnost in občutljivost metod in pa pridobili vpogled v učinkovitost in prednosti nove metode v primerjavi z konvencionalnimi tehnikami. Z novim pristopom smo uspešno zaznali število in natančno pozicijo vstavitve vektorja v genom gostiteljske celične linije, ter ocenili klonalni izvor celičnih linij z enako zanesljivostjo kot z metodo ciljnjega ojačevanje lokusov. Rezultati so bili 100% skladni, poleg tega pa smo z novim pristopom zaznali dodatna integracijska mesta, ki niso bila zaznana z metodo ciljnjega ojačevanja lokusov, kar nakazuje na višjo občutljivost novega pristopa. V nadaljevanju smo novo metodo »digitalni Southern blot« primerjali klasično metodo prenosa po Southernu. Za oceno integritete transgenov smo analizirali odčitke, ki so kazali le delno ujemanje z referenčnim nukleotidnim zaporednjem, kar lahko nakazuje na strukturne spremembe, kot so prelomi, preurejanja ali skrajšanja. Grafični prikazi relativne pokritosti transgena z odčitki, ki se niso v celoti ujemala z referenčnim nukleotidnim zaporedjem, so omogočili zaznavanje tovrstnih dogodkov, saj v primeru intaktne sekvence pričakujemo zgolj odčitke, ki se 100% ujemajo z referenčnim nukleotidnim zaporejem. S tem pristopom smo uspešno ocenili intaktnost transgenov, pri čemer smo za 96% analiziranih genov dobili enake rezultate kot s klasično metodo, kar odraža visoko točnost metode v ocenjevanju intaktnosti transgenov. Poleg tega smo z analizo sekvenčnih podatkov zaznali sekvenčne različice v frekvencah nad 5%. Tradicionalno bi podatek o sekvenčnih različicah pridobili s sekvenciranjem po Sangerju kjer je meja zaznave višja kot pri sekvenciranju naslednje generacije, običajno med 15 in 20%. Vsi pridobljeni rezultati nakazujejo na velik potencial razvitega pristopa kot celovite, prilagodljive in visokoprepustne rešitve za genetsko vrenotenje celičnih linij med razvojem bioloških zdravil. Metoda omogoča konsolidacijo več ločenih analiz v eno samo, kar prispeva k večji učinkovitosti, zanesljivosti in kakovosti v zgodnjih fazah razvoja proizvodnjih celičnih linij.
    Vrsta gradiva - magistrsko delo ; neleposlovje za odrasle
    Založništvo in izdelava - Ljubljana : [L. Šifkovič], 2025
    Jezik - slovenski
    COBISS.SI-ID - 251840259

    Povezava(-e):

    https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?id=174429

Vnos na polico